Homogenizator tkanek w mikrobiologii

Tkanki ludzkie stanowią niezwykle cenny materiał do badań w diagnostyce mikrobiologicznej. Często są one pozyskiwane metodami inwazyjnymi, takimi jak synowektomia czy osteotomia, co podkreśla potrzebę maksymalizacji uzyskanych informacji mikrobiologicznych i minimalizacji ryzyka zanieczyszczenia. W rutynowych procedurach laboratoryjnych próbki tkanek są często rozmazywane i rolowane na stałych podłożach hodowlanych. Jednak ta metoda może nie zapewniać pełnego kontaktu wszystkich części tkanki z powierzchnią podłoża, co potencjalnie obniża wskaźnik wykrywalności mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo wykrycia, wiele laboratoriów rutynowo inkubuje tkanki w pożywkach wzbogacających lub bulionach, co z kolei może zwiększać ryzyko zanieczyszczenia hodowli.

Czym jest homogenizator tkanek i do czego służy?

Homogenizator tkanek to urządzenie zaprojektowane do mechanicznego rozbijania tkanek. W środowisku badawczym są one od dawna stosowane do homogenizacji tkanek w celu zwiększenia uwalniania komórek z próbek. Argumentuje się, że mogą być one również wykorzystywane do uwalniania mikroorganizmów przyczepionych do tkanek, co potencjalnie poprawia ich wykrywalność w hodowli. Dodatkową korzyścią płynącą z użycia homogenizatorów jest możliwość standaryzacji procesu przygotowania próbki tkankowej, co może przyczynić się do większej powtarzalności wyników.

Jednym z dostępnych na rynku urządzeń tego typu jest gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotec GmbH). Jest to laboratoryjny aparat wykorzystujący metodę rotorowo-statorową do półautomatycznej dysocjacji tkanek na zawiesiny jednokomórkowe lub dokładne homogenaty. Do tej pory istniała luka w literaturze naukowej dotycząca oceny wydajności tego konkretnego homogenizatora tkanek w próbkach klinicznych od pacjentów.

Ocena gentleMACS Dissociator w badaniach klinicznych

Aby wypełnić tę lukę i zbadać dodatkową wartość stosowania wstępnego przetwarzania tkanek za pomocą homogenizatora, przeprowadzono badanie porównujące tę metodę z rutynową procedurą przetwarzania tkanek w diagnostyce mikrobiologicznej. Celem było określenie, czy użycie gentleMACS Dissociator zwiększa wykrywalność mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje.

Badanie opierało się na analizie próbek tkanek pobranych od pacjentów. Próbki te, często uzyskiwane drogami inwazyjnymi, są kluczowe dla postawienia prawidłowej diagnozy mikrobiologicznej, dlatego tak ważne jest, aby metoda ich przetwarzania była jak najskuteczniejsza.

Metodologia badania

Badanie miało charakter retrospektywny i objęło próbki tkanek pobrane w latach 2017-2020. Od każdego pacjenta wybrano tylko jedną próbkę. Próbki były przetwarzane w sterylnych warunkach. Każda próbka była dzielona na dwie części: jedna była poddawana rutynowej procedurze, druga zaś wstępnemu przetwarzaniu za pomocą gentleMACS Dissociator.

W rutynowej procedurze, fragmenty tkanki o średnicy około 3 mm były rozmazywane i rolowane na stałych podłożach agarowych, takich jak Columbia z 5% krwią baranią, Chocolate i MacConkey. Płytki te inkubowano w atmosferze tlenowej i 5% CO₂ w 35°C. Dodatkowo, zawiesinę z tkanki wysiewano na agar Brucella i inkubowano w warunkach beztlenowych w 35°C. Większość płytek inkubowano przez siedem dni, z wyjątkiem próbek z podejrzeniem infekcji materiału protetycznego lub zespalającego, które inkubowano przez czternaście dni. Do hodowli grzybów używano agaru Sabourauda i inkubowano go w 26°C i 35°C przez 21 dni. Ważne jest, że ze względu na często ograniczoną ilość materiału tkankowego, nie wykonywano hodowli w bulionach.

W przypadku metody z użyciem gentleMACS Dissociator, druga połowa próbki tkanki była przetwarzana w urządzeniu zgodnie z instrukcją producenta. Proces ten zajmował około 1 minuty.

Wyniki mikrobiologiczne z obu metod (rutynowej i z użyciem homogenizatora) były odczytywane przez doświadczonych techników laboratoryjnych, którzy byli zaślepieni co do danych klinicznych pacjentów i wyników z drugiej metody przetwarzania.

Przeprowadzono dwie główne analizy:

1. Porównanie wyników hodowli uzyskanych obiema metodami. Analiza ta mogłaby potencjalnie prowadzić do rozumowania cyklicznego, dlatego kluczowa była druga analiza.
2. Porównanie wyników obu metod z diagnozą kliniczną infekcji, która została przyjęta jako „złoty standard”. Diagnozy kliniczne były ustalane przez mikrobiologa klinicznego, również zaślepionego na wyniki badań laboratoryjnych, w oparciu o osąd kliniczny, objawy, wyniki badań laboratoryjnych (np. CRP) oraz standardowe kryteria diagnostyczne dla konkretnych typów infekcji (np. kryteria Duke'a dla zapalenia wsierdzia, standardowe kryteria dla infekcji okołoprotezowych czy zapalenia kości i szpiku, które często wymagają wielu pozytywnych hodowli z tym samym mikroorganizmem).

W drugiej analizie obliczono czułość i swoistość obu procedur (rutynowej i z użyciem homogenizatora) w odniesieniu do klinicznej diagnozy infekcji. Przeprowadzono również analizy podgrupowe dla tkanek okołoprotezowych oraz tkanek kości i stawów. Dodatkowa analiza wrażliwości polegała na wykluczeniu tkanek, w których spodziewano się wzrostu komensali (np. z ucha, nosa, gardła, przewodu pokarmowego). Badano również, czy wstępne przetwarzanie tkanki prowadzi do wykrycia dodatkowych mikroorganizmów w hodowlach polimikrobiologicznych i czy te dodatkowe drobnoustroje miały znaczenie kliniczne (np. wpływałyby na wybór antybiotyków). Porównano również odsetek pozytywnych wyników barwienia Grama dla mikroorganizmów i leukocytów między obiema metodami.

Kluczowe wyniki

W pierwszej analizie, porównującej bezpośrednio wyniki hodowli z obu metod, nie stwierdzono istotnej statystycznie różnicy w liczbie pozytywnych hodowli (test McNemara, p = 0.3). Spośród próbek, w których wzrost uzyskano obiema metodami (n=62), w 61 (98.4%) stwierdzono przynajmniej jeden podobny mikroorganizm. Dokładnie takie same mikroorganizmy znaleziono w 42/62 (67.7%) próbek.

Ważniejsze wnioski płyną z drugiej analizy, gdzie punktem odniesienia była kliniczna diagnoza infekcji. Spośród włączonych tkanek, 55/104 (52.9%) uznano za zakażone klinicznie. W tej analizie stwierdzono, że czułość procedury z użyciem homogenizatora tkanek (89.1%) była nieco niższa niż rutynowej procedury (83.6%).

Analiza podgrupowa wykazała bardziej zróżnicowane wyniki:

Warto zauważyć, że w przypadku tkanek okołoprotezowych czułość z użyciem homogenizatora była znacznie wyższa (96.3%) niż w rutynowej procedurze (77.8%). Natomiast dla tkanek kości sytuacja była odwrotna - rutynowa procedura wykazała wyższą czułość (88.6% vs 77.1%).

Analiza 9 tkanek z rozbieżnymi wynikami mikrobiologicznymi (gdzie jedna metoda wykryła wzrost, a druga nie) wykazała, że w jednym przypadku wzrost uznano za zanieczyszczenie (Cutibacterium acnes). W pozostałych ośmiu przypadkach tkanki uznano za zakażone. Homogenizator wykrył jednego S. aureus i jednego E. faecium, które zostałyby pominięte przez rutynową procedurę. Jednakże, homogenizator pominął również trzy szczepy gronkowców koagulazo-ujemnych, dwa szczepy Serratia marcescens i jednego Staphylococcus aureus, które zostały wykryte rutynową metodą.

Dyskusja i potencjalne wyjaśnienia

Istnieje wyraźna potrzeba poprawy czułości hodowli tkanek, szczególnie w przypadku przetwarzania tkanek okołoprotezowych. Proste rozmazywanie tkanki na płytkach agarowych może mieć ograniczoną czułość. Proponowano inne metody, takie jak wirowanie tkanek, inkubacja w bulionie lub butelkach do hodowli krwi, aby zwiększyć wydajność hodowli. Jednak te podejścia mogą prowadzić do zanieczyszczenia. Liza chemiczna i automatyczne homogenizatory tkanek to kolejne metody, które sugerowano w celu zwiększenia czułości diagnostycznej.

W omawianym badaniu stwierdzono, że homogenizator tkanek gentleMACS Dissociator nie wykazał istotnej różnicy w porównaniu z rutynowym przetwarzaniem, jeśli porównywano jedynie liczbę pozytywnych hodowli między metodami. Jednakże, gdy jako punkt odniesienia przyjęto kliniczną diagnozę infekcji, jego wydajność była w niektórych analizach niższa.

Dlaczego homogenizator mógł wykazywać niższą czułość w niektórych przypadkach? Można jedynie wysnuć hipotezę, że część populacji bakteryjnej mogła zostać zniszczona w tkance podczas procesu homogenizacji, prowadząc do powstania martwych komórek lub komórek żywotnych, ale niezdolnych do wzrostu w hodowli (viable but non-culturable state). Badania na zwierzętach z użyciem gentleMACS Dissociator wykazały, że uzysk bakterii był niższy niż bez przetwarzania tkanki. Inne badanie z innym homogenizatorem (MagNA Lyser Rotor) również wykazało zmniejszenie liczby żywotnych bakterii w tkance wieprzowej z inokulacją.

Inną metodą homogenizacji są młyny kulkowe. Badanie z użyciem młyna kulkowego Ultra-TurrAX w 38 próbkach tkanek okołoprotezowych od pacjentów z artroplastyką kolana również wykazało gorsze wyniki w porównaniu do rutynowej metody mikrobiologicznej.

Ciekawym kontrastem jest użycie homogenizatorów do uwalniania bakterii z wymazów. W takim przypadku destrukcja bakterii nie wydaje się występować, być może dzięki ochronie zapewnianej przez materiał syntetyczny wymazówki. Jednak próbki wymazów nie są preferowanym typem próbek do diagnozowania infekcji okołoprotezowych czy zapalenia kości i szpiku.

W badaniu użyto również 1.5 ml płynu z tkanką, co rodzi możliwość, że rozcieńczenie próbki mogło wpłynąć na niższą wydajność homogenizatora. Jednak po zakończeniu procesu homogenizacji objętość końcowa była bardziej skoncentrowana, więc efekt rozcieńczenia mógł nie być znaczący.

Mimo potencjalnie ograniczonej wydajności w niektórych analizach, gentleMACS Dissociator okazał się wygodny w użyciu. Program trwał tylko 1 minutę, a czas pracy ręcznej był stosunkowo krótki (< 5 minut). Urządzenie nie sprawiało regularnych problemów mechanicznych.

Ograniczenia badania

Należy zauważyć, że badanie to miało pewne ograniczenia. Nie zostało zaprojektowane do oceny wydajności wstępnego przetwarzania tkanek w kontekście wykrywania konkretnych typów infekcji, takich jak infekcje okołoprotezowe, gdzie inne metody, jak sonikacja, mogą być stosowane do zwiększenia wyników hodowli. Ponadto, generalizacja wyników może być ograniczona w przypadku infekcji niskiego stopnia, ponieważ włączone tkanki pochodziły głównie z operacji rewizyjnych, gdzie kliniczne podejrzenie infekcji było już wysokie, co widać po wysokiej czułości ogólnej metod. Charakter retrospektywny badania również stanowi ograniczenie.

Wnioski i znaczenie kliniczne

Wyniki przedstawione w tym badaniu mogą pomóc mikrobiologom klinicznym, specjalistom chorób zakaźnych i kierownikom laboratoriów w interpretacji wyników hodowli tkanek przetwarzanych różnymi metodami oraz w podejmowaniu decyzji dotyczących wdrożenia homogenizatorów tkanek w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej. Choć gentleMACS Dissociator oferuje standaryzację i wygodę, jego potencjalnie niższa wydajność w wykrywaniu niektórych patogenów, zwłaszcza w tkankach kości, wymaga ostrożności. Z drugiej strony, jego wyższa czułość w tkankach okołoprotezowych jest obiecująca, biorąc pod uwagę trudności w diagnozowaniu tych infekcji. Decyzja o zastosowaniu tej technologii powinna być oparta na dokładnej analizie potrzeb laboratorium i rodzaju badanych próbek, z uwzględnieniem zarówno wydajności diagnostycznej, jak i efektywności operacyjnej.

Często zadawane pytania

Co to jest homogenizator tkanek?
To urządzenie służące do mechanicznego rozbijania i rozdrabniania próbek tkanek, często w celu uzyskania zawiesiny komórek lub dokładnego homogenatu.

Do czego służy homogenizator tkanek w laboratorium mikrobiologicznym?
Jego głównym celem jest ułatwienie uwolnienia mikroorganizmów uwięzionych w strukturze tkanki, aby zwiększyć szanse na ich wykrycie w hodowlach mikrobiologicznych.

Czy użycie homogenizatora tkanek jest zawsze lepsze niż tradycyjne metody?
Niekoniecznie. Badanie wykazało, że choć w niektórych przypadkach (np. tkanki okołoprotezowe) czułość może być wyższa, w innych (np. tkanki kości) rutynowa metoda może być skuteczniejsza. Istnieją hipotezy, że proces homogenizacji może w pewnym stopniu uszkadzać komórki bakteryjne.

Czy homogenizator gentleMACS Dissociator niszczy bakterie?
Badanie sugeruje, że niższa wydajność w niektórych analizach może być związana z potencjalnym zniszczeniem części populacji bakteryjnej podczas procesu homogenizacji, choć wymaga to dalszych badań.

Czy badanie dotyczyło konkretnego typu infekcji?
Badanie objęło różne typy tkanek i infekcji, ale nie było specyficznie zaprojektowane do oceny wydajności metody w diagnozowaniu konkretnych jednostek chorobowych, takich jak infekcje okołoprotezowe, gdzie stosuje się również inne specjalistyczne metody, np. sonikację.

Jeśli chcesz przeczytać więcej interesujących artykułów jak 'Homogenizator tkanek w mikrobiologii', odwiedź kategorię Uroda.